Питер Сарнов редакторы, Стэнфорд университеты медицина мәктәбе, Стенфорд университеты, Калифорния, 2020 елның 25 декабрендә расланды (2020 елның 25 октябрендә карала)
Коронавирус-транскрипция комплексларын репликацияләүдә субунитлар арасындагы үзара бәйләнеш турында хәбәр итәбез, алар кабатлау һәм эволюцион саклау өчен мөһим.Без nsp12 белән бәйләнгән NiRAN доменының трансда нуклеозид монофосфат (NMP) күчерү эшчәнлегенә ия булуын расладык, һәм аның максаты итеп nsp9 (РНК бәйләүче протеин) билгеләдек.NiRAN, Mn2 + ионнарына һәм янәшә сакланган Асн калдыкларына таянган реакциядә, NMP9 аминок терминалына NMP ковалент бәйләнешен катализацияли.NiRAN эшчәнлеге һәм nsp9 NMPylation коронавирус репликасы өчен бик кирәклеге ачыкланды.Мәгълүматлар ояланган вирус фермент маркерының бу эшчәнлеген РНК вируслары классында РНК синтезы инициативасы функциональ һәм эволюцион эзлекле булган гипотезадагы алдагы күзәтүләр белән бәйләргә мөмкинлек бирә.
Нидовиралесның (Coronaviridae, Arterioviridae һәм башка 12 гаилә) РНКга бәйле РНК полимеразы (RdRps) NiRAN дип аталган полипротеиннан чыккан структур булмаган протеин (n-терминал) домены белән бәйләнгән. 1аб вируслы төп протеаздан тора (Mpro).Элегерәк, NiRAN-RdRp nsp артериаль вирусы GMPylation / UMPylation эшчәнлеге турында хәбәр ителде, һәм нуклеозид монофосфатын (NMP) (хәзерге вакытта билгесез) вируска һәм / яки күзәнәк биополимеризация әйберләренә күчү өчен вакытлыча ясарга тәкъдим иттеләр.Монда без күрсәтәбез, коронавирус (Кеше Coronavirus [HCoV] -229E һәм Каты кискен сулыш синдромы Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) Mn2 + бәйләнешле NMPylation эшчәнлеге бар, ул Msp-арадаш nsp9 формалашу аркасында nsp9дан алынган. N-терминал янындагы nsps протеолитик рәвештә чыгарыла, фосфорамидат nsp9 N-терминалында төп аминга (N3825) бәйләнгән.Уридин трифосфат - бу реакциядә өстенлекле нуклеотид, ләкин адененоз трифосфат, гуанозин трифосфат һәм цитидин трифосфат шулай ук яраклы субстратлар.Рекомбинант коронавирус nsp9 һәм nsp12 белгечләрен кулланып, генетик инженерланган HCoV-229E мутацияләре NiRAN-медиа nsp9 NMPylation һәм күзәнәк культурасында вирусны күчерү өчен кирәкле калдыкларны билгеләделәр.Мәгълүматлар NiRAN актив сайт калдыкларын фаразлауны расладылар һәм nsp9 N3826 калдыкларының nsp9 NMPylation һәм витрода вирус репликасында мөһим ролен билгеләделәр.Бу калдык сакланган N-терминал NNE трипептид эзлеклелегенең бер өлеше һәм коронавируслар гаиләсендә nsp9 һәм аның гомологларының бердәнбер инвариант калдыклары булып исбатланды.Бу тикшеренү башка ояланган вирусларның NMPylation эшчәнлеген функциональ өйрәнү өчен ныклы нигез бирә һәм вируска каршы препаратлар үсеше өчен мөмкин булган максатларны тәкъдим итә.
Нидовиралес уңай полосалы РНК вирусы төрле умырткасыз һәм умырткасыз хайваннарны зарарлый (1, 2).Заказ хәзерге вакытта 14 гаиләне (3) үз эченә ала, шуларның соңгы 20 елда Коронавирус гаиләсе киң өйрәнелгән.Ул вакытта хайваннар хуҗаларыннан өч зоонотик коронавирус барлыкка килде һәм кешеләрдә зур сулыш инфекцияләренең киң таралышына китерде.Шул исәптән каты кискен йогышлы авырулар аркасында килеп чыккан өзлексез пандемия.Коронавирус сулыш синдромы 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Нидовируслар уртак геном оешмасы белән уртаклашалар, һәм мембраналар белән бәйләнгән репликация-транскрипция комплексының субунитасы 5-? Terminal терминалының өчтән ике өлешендә һәм вирус кисәкчәсенең төп структур субунитасында, шулай ук кайбер аксессуарларда кодланган. .Протеин, геномның 3 ?? ² ахырында кодланган (1).Планар вирусларның бер гаиләсеннән кала (Моновирида) (8), барлык ояланган вируслар RTC субуниталарын ике зур ачык уку рамкасында кодлыйлар (ORF) ORF1a һәм ORF1b, алар геном РНКыннан тәрҗемә ителәләр.ORF1a полипротеинны (pp) 1a кодлый, һәм ORF1a һәм ORF1b бергә pp1ab кодлый.ORF1a белән кодланган төп протеазның (Mpro) гомуми катнашуы белән, pp1a да, pp1ab да протеолитик рәвештә төрле структур булмаган протеиннарда эшкәртелә, алар шулай ук 3CLpro дип атала, чөнки аның пикорнавирусның 3Cpro белән гомологиясе бар ( 9).Бу nsps зур динамик РТКка җыелган, геном РНК синтезын катализацияли һәм субгеномик РНК җыелмасы (транскрипция), һәм ORF1b (10) агымында урнашкан ORF экспрессиясен координацияләү өчен кулланыламы? ? 12).
RTC үзәгендә РНКга бәйле РНК полимеразы (RdRp) (13), күп балалы 1 геликаз (HEL1) (14, 15) һәм берничә РНК эшкәртү ферментлары бар, алар нигездә ORF1b һәм коронавирус гаиләсендә кодланган nsp12-nsp16 һәм nsp9-nsp12 Артериовирида гаиләсендә (10ââ 12 сылтаманы карагыз).RdRp һәм HEL1 кош оясы вирусының ике (биштән бере) сакланган доменын күрсәтәләр һәм башка РНК вируслары арасында гомологиягә ия.Төп реплика башка субунитлар ярдәмендә булышыр дип санала, шул исәптән pp1a карбокси-терминалыннан (C-терминал) чыгарылган Mpro агымы (коронавирус nsp5 һәм артериаль вирус nsp4).Аларның чикләнгән гаиләгә хас саклаулары һәм төрле эшчәнлеге бар (10â12 сылтамада карала).
Күптән түгел, барлык эзлекле вирусларда RdRp янындагы аминок терминалда (N-терминус) уникаль эзлекле мотив характеристикасы булган домен табылды, ләкин бүтән РНК вируслары юк (16).Аның урнашуына һәм нуклеотид трансферазына (нуклеосид монофосфат [NMP] трансфераз) эшчәнлегенә нигезләнеп, бу домен NiRAN дип атала (Nestvirus RdRp белән бәйле нуклеотид трансферасы).NiRAN-RdRp-ның ике-домен кушылмасы Coronaviridae гаиләсендә nsp12 һәм Артериовирида гаиләсендә nsp9 тәшкил итә, һәм башка нестовиридада, NiRAN-RdRp вируслы полипротеиннан бәйсез nsp булып чыгарылыр дип көтелә.Коронавируста, NiRAN доменында ?? 1/450 калдык бар һәм C-терминалы RdRp доменына бәйләүче төбәк аша тоташтырылган (16? 19).Тигез артерит вирусында (EAV) (Arteriviridae), рекомбинант nsp9 Mn2 + ионга бәйле (үз) UMPylation һәм GMPylation эшчәнлеген күрсәтә, алар нестовирус, AN, BN һәм CN өч калдык эзлеклелегенә бәйле.Кайда N NiRAN дигәнне аңлата) (16).Бу мотивларның N-терминалы азрак консерватив мотив preAN.Бу калдыкларның кайберләре шулай ук ерактагы протеин киназаларында саклана, аларда нуклеозид трифосфат (NTP) бәйләү һәм катализатор эшчәнлегендә катнашулары күрсәтелде (20, 21).Бу күзәтүгә туры китереп, Псевдоном шприцыннан SelO псевдокиназындагы берничә төп актив калдыклар күптән түгел бастырылган SARS-CoV-2 nsp7 / 8/12/13 суперкомплексы белән җыелырга мөмкин.Электрон микросруктурада коронавирус NiRAN калдыклары.Рекомбинант белок (17).Документацияләнгән (үз) U / GMPylation NMPны (хәзерге вакытта билгесез) субстратка (16) күчерү өчен вакытлы хәл тудырачак, һәм NiRAN белән белок киназы (17, 19) арасында структур охшашлык гипотезамы? NiRAN бүтән протеиннарны үзгәртә.
Күпчелек үзенчәлекләр, шул исәптән ояланган вируслар белән уникаль һәм уникаль системалы ассоциация һәм RdRp белән генетик аерылу, NiRANны ояланган вируслар өчен төп көйләү ферменты итә, бу аларның барлыкка килүе һәм үзенчәлеге өчен бик мөһим.Элегерәк, геном / субгеномик тәрҗемә яки репликация / транскрипцияне көйләү өчен NiRAN катнашындагы өч мөмкин функция чакырылган иде.Ул вакытта булган бик аз һәм тулы булмаган мәгълүматны исәпкә алганда, һәр функциянең өстенлекләре һәм кимчелекләре бар (16).Бу тикшеренүләрдә без ике төрне күрсәтүче коронавирусларның биохимик һәм кире генетик тикшеренүләрен берләштерергә, һәм табышмакларыбызны коронавирус гаиләсенең табигый мутациясенең эволюцион фонына куярга, бу серле өлкә турында төшенергә телибез.Без NiRANны аңлаудагы зур казанышларны РТКтагы табигый максатларны ачыклау аша хәбәр итәбез, алар (булган өч гипотеза арасында) ояланган вирус РНК синтезын башлауда бу домен роленә булышалар.Бу тикшеренү шулай ук NiRANның вирус хуҗасы интерфейсындагы башка рольләренә мөмкинлекләр ача.
Nsp12 белән бәйле NiRAN доменындагы корона вирусының энзиматик үзлекләренә характеристика бирү өчен, без Э.Колида кеше коронавирусы 229E (HCoV-229E) nsp12 рекомбинант формасын чыгардык, һәм C-терминалда His6 тамгасы белән кушылдык. белок [α32-P] NTP белән бергә MnCl2 булганда инкубацияләгез, материаллар һәм методларда күрсәтелгәнчә.Реакция продуктын анализлау радиолабельле протеинның nsp12 (106 kDa) белән бергә күчүен күрсәтте, коронавирус nsp12 ковалент белок-NMP кушылмалары формалашуны катализацияли, өстенлекле рәвештә уридин монофосфаты (UMP) белән ясалган (1А рәсем) һәм Б).Санлы анализ күрсәткәнчә, башка нуклеотидлар белән чагыштырганда, UMP кушылуның сигнал интенсивлыгы 2-3 тапкыр арткан (Рәсем 1C).Бу мәгълүматлар коронавирусның NiRAN доменының фаразланган NMP күчерү эшчәнлегенә туры килә, ләкин коронавирусның NiRAN доменының нуклеотид өстенлекләре һәм артериаль вирус төрле булуын күрсәтә.
HCoV-229E nsp12 үз-үзен NMPylation эшчәнлеге.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) билгеләнгән [α-32P] NTP белән 6 мм MnCl2 булганда 30 минут эчендә инкубацияләнде (детальләр өчен материаллар һәм ысуллар карагыз).Реакция продуктлары SDS-PAGE белән аерылды һәм Coomassie якты зәңгәр төс белән буялды.Б) Радиолабельле протеин фосфорлы күзаллау белән визуальләштерелгән.Nsp12-His6 һәм протеин молекуляр масса маркерлары (килодальтоннарда) A һәм B күрсәтелә (C) Радиоактив сигналның интенсивлыгы (уртача ± SEM) өч бәйсез эксперименттан билгеләнде.* P≤0.05.Сигнал көче (процент) UTP белән бәйле.
NiRAN белән бәйле фермент эшчәнлеге EAV һәм SARS-CoV күзәнәк культурасында кабатлану өчен мөһим булып күрсәтелсә дә, конкрет NiRAN функциясе һәм потенциаль максатлар әлегә билгеләнмәгән.Күптән түгел хәбәр ителгән NiRAN һәм белоклар киназына охшаган протеиннар гаиләсе арасында структур охшашлык (17, 22) безне NiRAN башка протеиннарның NMPylation катализаторы дигән гипотезаны сынап карарга этәрде.Без потенциаль гомологик максатлар җыелмасын булдырдык, алар арасында HCoV-229E ORF1a белән кодланган структур булмаган протеиннар (nsps 5, 7, 8, 9, 10), аларның һәрберсендә C6 терминалы His6 теге (SI кушымтасы, S1 таблицасы), һәм nsp12 булганда яки булмаганда, бу протеиннарны [α32-P] уридин трифосфат ([α32-P] UTP) белән инкубацияләгез.Э.Колида җитештерелгән бовиний серум альбумин һәм MBP-LacZα кушылу протеины контроль булып хезмәт иттеләр (2A рәсем, 1-7 юллар).Радиолабельле протеин натрий додецил сульфат-полиакриламид гели электрофорезы (SDS-PAGE) һәм авторадиография белән анализланган, һәм nsp12 һәм nsp9 булган реакциядә көчле радиоактив сигнал барлыгы ачыкланган.Сигналның позициясе nsp9 молекуляр массасына туры килә, nsp9-ның уртача UMPylation күрсәтүен күрсәтә (2-нче рәсем, трек 7).Башка сынау протеиннары UMPylated дип табылмады, бу безгә nsp9 nsp12-ның билгеле субстраты дигән нәтиҗәгә китерде.1-нче рәсемдә күрсәтелгән үз-үзен NMPylation мәгълүматларына туры китереп, nsp12 барлык дүрт NMP-ны nsp9-ка күчерә ала, эффективлыгы төрле булса да, UMP> аденозин монофосфат (AMP)> гуанозин монофосфат (GMP)> цитидин монофосфат (CMP)) ( Рәсем).3 А һәм В).Бу анализда кулланылган шартларда (реакцияне һәм экспозиция вакытын кыскартырга, nsp12 концентрациясен киметергә; материаллар һәм ысуллар), nsp12-ның үз-үзен NMPylation табып булмады (2-нче рәсем, 7-нче юл, 1-нче рәсем белән чагыштырыгыз). эффектив (һәм берничә тур) UMP nsp12-дән nsp9-ка күчте.UMP күчерү эшчәнлеге, 3C рәсемдә күрсәтелгәнчә, Mn2 + ионнары булуын таләп итә, ә минималь UMP күчерү активлыгы Mg2 + булганда гына күзәтелә, һәм калган ике дивалентлы катион катнашында бернинди активлык та юк.Мондый мәгълүматлар цитидин трифосфат (CTP), гуанозин трифосфат (GTP), һәм адененоз трифосфат (ATP) (SI кушымтасы, С1 рәсем) булган NMPylation анализларында алынган.
HCoV-229E nsp12-nsp9-ның уртача UMPylation.HCoV-229E nsp12-His6⁺-арадашлы UMPylation эшчәнлеген бәяләү өчен протеин субстратлары сериясе (шул исәптән албумин, MBP-lacZα, һәм HCoV-229E nsps C-терминалы His6 белән билгеләнгән) кулланылды. протеин.Протеинны [α-32P] UTP белән 10 минут дәвамында инкубацияләгез (A) яки nsp12 булмаганда (B) материалларда һәм ысулларда күрсәтелгәнчә.А һәм В өсләрендә, Coomassie Brilliant Blue белән буялган SDS-полиакриламид гели күрсәтелә, һәм A һәм B төбендә тиешле авторадиограммалар күрсәтелә.Протеин молекуляр масса маркерының позициясе (килодальтоннарда) сулда бирелгән.Nsp12-His6 (B, өс) позициясе һәм nsp9-His6 (B, 7 юл) белән nsp12-His6 инкубация вакытында күзәтелгән радиоактив сигнал шулай ук күрсәтелә, бу күрсәтә [α-32P] UMP - nsp9-His6 (12,9 кДа), тикшерелгән бүтән протеиннар өчен күзәтелмәгән.
HCoV-229E NiRAN-арадаш биохимик һәм вирусологик характеристика nsp9 NMPylation.(А һәм В) Реакциядә кулланылган нуклеотид ко-субстратының роле.Nsp12-His6 һәм nsp9-His6 катнаш һәм инкубацияләнәләр, стандарт NMPylation анализында төрле [α-32P] NTPлар булганда.(А, өстә) SDS-PAGE белән аерылган Coomassie-nsp9-His6.(А, аста) Гельнең бер үк мәйданының авторадиографы.Б) Нуклеотид кофакторы булганда чагыштырмача активлык (уртача ± SEM) өч бәйсез эксперименттан билгеләнә.* P≤0.05.В) металл ионнары роле.[Α-32P] UTP һәм төрле металл ионнары булганда, һәрберсендә 1 мм концентрациясе булган стандарт NMPylation тесты күрсәтелә.C, өске, Coomassie буялган nsp9-His6, ә C, аскы өлештә тиешле авторадиография күрсәтелә.Билгеләнгән протеинның зурлыгы (килодальтоннарда) А һәм С сул ягында күрсәтелә (D) HCoV-229E nsp12-His6 мутант формасы күрсәтелгән аминокислотаны алыштыруны алып бара, тасвирланганча [α-32P] UTP. материалларда һәм методларда.NMPylation реакциясендә җитештерелгән nsp9-His6 радиолабельле фосфориляция тасвирламасы белән ачыклана (D, өстә).Кыргый типтагы (wt) протеин белән чагыштырганда чагыштырмача активлык Dда күрсәтелә, һәм аскы өч бәйсез эксперименттан уртача (± SEM) итеп алына.Йолдызлыклар сакланмаган калдыкларны алыштыруны күрсәтәләр.(E) В1 вирусы, p1 күзәнәкләренең супернатанты, инфекция тәлинкә анализы белән билгеләнгәннән соң 24 сәгатьтән соң алынган.Моторлы HCoV-229E мутантының NiRAN доменындагы кодны алыштыру күрсәтелә (калдыкларны номерлау аларның pp1abдагы позициясенә нигезләнеп).Репликация җитешмәгән RdRp актив сайт мутанты nsp12_DD4823 / 4AA контроль буларак кулланылды.
NiRANның актив сайтын тирәнрәк аңлау һәм nsp9 специфик NMP күчерү эшчәнлеге белән бәйле калдыкларны ачыклау өчен, без мутация анализы ясадык, анда консерватив калдыкларны NiRAN AN, BN һәм CN мотивларында алыштырдык ( 16) Бу Ала (SI кушымтасы, С2 рәсем).Моннан тыш, консерватив Arg-to-Lys яки Lys-to-Arg алмаштыру тәэсире ике очракта бәяләнде.(Тискәре) контроль буларак, коронавирусларның һәм башка ояланган вирусларның NiRAN доменында сакланмаган яки аз сакланган калдыклар Ала белән алыштырыла. K4116A (мотив мотивында), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (мотив) BN) һәм D4280A (CN) nsp9 NMPylation-ны nsp12 аша сизелерлек киметәләр яки бетерәләр, ә консерватив алмаштыргыч белгечләр (R4178K), K4116R) 60% һәм 80% активлыгын саклыйлар, бу үз якларында чикләүләрнең йомшаруын күрсәтә. чылбырлар физикохимик яктан сизгер (3D рәсем).E4145A, D4273A, F4281A һәм D4283A сакланган берничә калдыкны алыштыру күпкә зарарлы түгел, һәм nsp9 UMPylation уртача кими.Охшаш нәтиҗәләр башка NTP катнашындагы nsp9 NMPylation реакцияләрендә алынган (рәсем 3D һәм SI кушымтасы, S3 рәсем), билгеле аминокислоталарны алмаштыруга күзәтелгән эффектлар кулланылган нуклеотид ко-субстрат төреннән бәйсез булуын раслый.Алга таба, без бу nsp12 алмаштыруларының күзәнәк культурасында коронавируслар репликасына мөмкин булган тәэсирен сынадык.Бу максаттан без 5-7 күзәнәкләрен транскрипцияләү өчен рекомбинант вакцина вирусында клонланган (23, 24) генетик инженерлык тулыландырылган ДНК (CDNA) шаблоннарын кулландык.Бу күзәнәкләрдә җитештерелгән йогышлы вирус токымының титрациясе HCoV-229E NiRAN мутацияләренең күбесенең мөмкин булмаганын күрсәтте (3E рәсем).Вируслы мутантлар төркеменә витродагы NMP күчерү активлыгын бетерү яки сизелерлек киметү өчен күрсәтелгән альтернативалар керә (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), ләкин тагын ике альтернатива бар (K4116R, E4145A) 80 % сакланган?Аларның витро NMPylation эшчәнлеге өстәмә чикләүләр катнашуын күрсәтә.Шулай ук, тагын ике мутация (R4178K, F4281A) NiRAN витро NMPylation эшчәнлегенең уртача кимүенә китергән тере вируслар тудырды, ләкин бу вируслар репликация ярдәмендә титерларны сизелерлек киметтеләр.3D рәсемдә күрсәтелгән витро эшчәнлеге мәгълүматларына туры китереп, коронавирда һәм / яки бүтән ояланган вирусларда (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) дүрт калдыкны алыштырып, токымлы вируслар тудырдылар. кыргый вирус белән чагыштырганда уртача киметелгән титер (рәсем 3E).
NiRAN-арадаш NMP трансфераз эшчәнлеге актив RdRp доменына бәйле булу-булмавын өйрәнү өчен, RdRp мотивында дивалент металл ионнарын координацияләүдә катнашкан ике консервланган Asp калдыклары Ала белән алыштырылды. Нәтиҗәдә nsp12_DD4823 / 4AA белок саклана. аның nsp9 NMPylation эшчәнлеге, nsp12-витро nsp9 NMPylation эшчәнлегенең полимераз активлыгын таләп итмәвен күрсәтә (SI Кушымта, С4 рәсем).
Nsp12 өчен Nsp9-специфик NMP күчерү эшчәнлеген булдырганнан соң, без NMP-nsp9 кушылмасын масса спектрометрия (MS) белән характерларга тырыштык.Рекомбинант HCoV-229E nsp9 протеинның тулы спектры 12,045 Да иң югары күрсәткечне күрсәтте (4A рәсем).Nsp12 кушылуы nsp9 сыйфатын үзгәртмәде, бу nsp12 һәм nsp9 кулланылган шартларда тотрыклы комплекс барлыкка килмәвен күрсәтә (денатурация) (4A рәсем).UTP һәм GTP булганда, nsp9 һәм nsp12 булган реакциянең массалы үлчәве күрсәткәнчә, UTP белок массасы 306 Da хәрәкәт иткән, һәм GTP белок массасы 345 Da күчкән, бу һәр nsp9 молекуласының UMP яки GMP бәйләгәнен күрсәтә. (4 нче рәсем) С һәм Г).NiRAN-mediated nsp9 NMPylation өчен кирәк булган энергия NTP гидролизы һәм пирофосфат чыгарудан килә дип фаразлана.Бу реакциядә nsp9 (фермент) белән чагыштырганда 10 тапкыр артыграк кулланылса да, nsp9 белән тулы NMPylation күзәтелде, бу nsp12 белән nsp9 арасындагы үзара бәйләнешнең кыска гомерле булуын күрсәтә, һәм nsp12 NMPylate күбрәк nsp9 ясый ала. витро молекуласы.
Nsp12 һәм UTP яки GTP булганда nsp9ның бердәнбер NMPylation.HCoV-229E nsp9 (SI кушымтасы, S1 таблицасы) (AD) деконволюцияләнгән тулы протеин масса спектры күрсәтелә.(A) nsp9 берүзе, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 UTP булганда, (D) nsp9 + nsp12-His6 GTP булганда.
Nsp9 калдыкларын ачыклау өчен, nsp12 белән UMPylated, nsp9-UMP трипсин белән ярылган.Нәтиҗә ясалган пептидлар нано-югары җитештерүчән сыек хроматография (HPLC) белән аерылды һәм тандем масса спектрометриясе (MS / MS) белән анализланды.Бионик программа пакеты (Протеин Метрикасы) ярдәмендә мәгълүмат анализы N-терминал аминокислотасының UMPylation күрсәтте.Бу кул белән расланган.Прекурсор пептидының тандем масса спектры [UMP] NNEIMPGK (SI кушымтасы, С5А рәсем) 421 м / з фрагментны ачты, бу UMP nsp9 калдыклары белән бәйләнгәнен күрсәтә.
Nsp9 N-терминусында, Асн Ортокоронавирина әгъзалары арасында саклана (SI кушымтасы, С6 рәсем).Н-терминалдагы амин азот UMP өчен иң мөгаен кабул итүче дип санасак та, N-терминалда NMP бәйләнешенең өстәмә дәлилләрен алырга булдык.Шул сәбәпле, HPLC белән чистартылган NMPylated булмаган һәм NMPylated N-терминал пептид nsp9 ацетон һәм натрий цианоборохидрид булганда алынган.Бу шартларда пропил (25) белән бушлай беренчел аминнар гына үзгәртелә ала.NNEIMPGK эзлеклелеге белән N-терминалдан алынган пептид ике төп аминны үз эченә ала, берсе Аснның N-терминусында, икенчесе C-терминалдагы Lys ян чылбырында.Шуңа күрә пропил төркемнәрен ике очында да кертергә мөмкин.NMPylated булмаган пептидларның алынган ион хроматограммалары SI кушымтасында күрсәтелгән, S5B рәсеме.Көтелгәнчә, N-терминал һәм С-терминал (моно) пропиляцияләнгән (SI кушымтасы, С5Б рәсеме, өске полоса) һәм дипропилатланган пептидлар (SI кушымтасы, С5Б рәсеме, аскы полоса) ачыкланырга мөмкин.Бу форма nMP9 NMPylated N-терминал пептиды куллану белән үзгәрә.Бу очракта C-терминал пропиляцияләнгән пептидлар гына ачыклана ала, ләкин N-терминал пропиляцияләнгән пептидлар һәм дипропилатланган пептидлар ачыкланмый (SI Кушымта, S5C рәсем), бу UMP N-терминалның төп аминасына күчерелгәнен күрсәтә. үзгәрешләр кертүдән төркем.
Алга таба, без (Ала яки Сер белән) алыштырабыз яки nsp9 N-терминалында сакланган калдыкларны бетерәбез, максатчан чикләүләрне билгеләү өчен.NiRAN nsp9-N-терминал калдыкларының төп амины белән nsp9-NMP кушылмасы формалаштырган MS мәгълүматларына нигезләнеп, без фаразладык, nsp9 NMPylation вирус мастер протеазын (Mpro, nsp5) nsp9 N-терминалдан чыгаруны таләп итә. аның полипротеин прекурсоры.Бу гипотезаны сынап карау өчен, без Э.Колида nsp9 булган nsp7-11 прекурсоры белок җитештердек һәм [α-32P] UTP (материаллар һәм ысуллар) булганда NMPylation стандарт тест үткәрдек.5A рәсемдә күрсәтелгәнчә (3-нче юл), киселмәгән nsp7-11 прекурсоры nsp12 белән радиолабельле түгел.Киресенчә, әгәр nsp7-11 рекомбинант белән nsp9 (һәм башка nsps) прекурсордан чыгарылса, nsp9 белән күченгән радиолабельле белок табыла, бу безнең нәтиҗәне раслый, NiRAN һәм N- ковалент nsp9-NMP кушылмаларының сайлап формалашуы. .N-терминал Asn терминалының төп аминасы (pp1a / pp1ab-та 3825 позиция).Бу нәтиҗә шулай ук N-терминалда бер-ике өстәмә калдык булган nsp9 конструкторын кулланып экспериментлар ярдәмендә хуплана.Ике очракта да nsp9-ның уртача UMPylation бетерелде (SI Кушымта, S7 рәсем).Алга таба, без nsp9 N-терминалында 3825-NNEIMPK-3832 пептид эзлеклелегеннән бетерелгән бер-ике Asn калдыклары булган протеин җитештердек.Ике очракта да nsp9 UMPylation тулысынча блокланган (рәсем 5B), чын nsp9 N-терминус NMP рецепторы булып эшләвен өстәмә дәлилләр китереп.
Nsp9-ны протеолитик эшкәртү һәм N-терминал калдыкларының nsp12-арадаш UMPylationдагы роле.(A) nsp9 UMPylation бушлай nsp9 N-терминал таләп итә.Nsp7-11-His6 рекомбинант Mpro (nsp5-His6) булганда яки булмаганда UTP булган NMPylation ачыклау буферында 30 ° C алдан инкубацияләнә.3 сәгатьтән соң, NMPylation анализын материаллар һәм методларда күрсәтелгәнчә nsp12-His6 кушып башлап җибәрегез.Контроль буларак nsp5-His6 (1 юл) һәм nsp9-His6 (2 юл) булган реакция кулланылды.10 минуттан соң реакция туктатылды һәм реакция катнашмасы SDS-PAGE белән аерылды.Протеин Coomassie Brilliant Blue белән буялган (А, өстә).Уң якта Nsp7-11-His6 прекурсоры һәм nsp5-His6 арадаш ярылу нәтиҗәсендә эшкәртелгән продукт күрсәтелгән.Зинһар, игътибар итегез (кечкенә күләмнәре аркасында) nsp7 һәм nsp11-His6 бу гельдә ачыкланмый, һәм реакция nsp5-His6 белән тулыландырыла (1 һәм 4 юллар; nsp5-His6 позициясе каты түгәрәк белән күрсәтелә) яки nsp9-His6 (2 нче юл) аз күләмдә MBP (ачык түгәрәкләр белән күрсәтелә) калдык пычраклары булып тора, чөнки алар MBP кушылу протеиннары (SI кушымтасы, S1 таблицасы).)B, SDS-PAGE Coomassie белән буялган, өстендә, В, аскы өлештә тиешле авторадиограф күрсәтелгән.Молекуляр авырлык маркерының торышы (килодальтоннарда) сулда күрсәтелгән.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-терминалда сакланган калдыклар Ала яки Сер белән алыштырылды, һәм шул ук күләмдә протеин nsp12-His6 арадаш UMPylation реакциясендә кулланылды.Реакция продуктлары SDS-PAGE белән аерылды һәм Coomassie Brilliant Blue (C, өстә) белән буялды, һәм nsp9-His6 радиолабельле фосфорсессия күзаллау ярдәмендә табылды (C, урта).Кыргый типтагы (wt) протеинны белешмә буларак кулланып (100% итеп куелган), чагыштырмача NMPylation эшчәнлеге (уртача ± SEM) өч бәйсез эксперименттан исәпләнде.(D) HCoV-229E кыргый типтагы Huh-7 күзәнәкләре белән зарарланган Huh-7 күзәнәкләренең p1 күзәнәк культурасындагы вирус титерлары, һәм nsp9да билгеләнгән аминокислотаны алыштыручы мутантлар такта анализы белән билгеләнде.Тискәре контроль буларак RdRp мотивы C икеләтә мутант DD4823 / 4AA репликасы җитешмәгән.
Nsp9 N-терминалы (аеруча 1, 2, 3, 6 позицияләр) Ортокоронавирина субфамиля әгъзалары арасында бик сакланган (SI кушымтасы, С6 рәсем).Бу калдыкларның nsp12-арадашлы nsp9 NMPylationдагы ролен өйрәнү өчен, nsp9 N-терминалында бер-бер артлы ике Asn калдыклары Ала яки Сер белән алыштырылды (ялгыз яки комбинациядә).Кыргый типтагы nsp9 белән чагыштырганда, N3825ны Ала яки Сер белән алыштыру nsp12-арадаш UMPylationның ике тапкырга кимүенә китерде (5C рәсем).NMPylation N-терминал калдыкларының ян чылбыры урынына N-терминалдагы төп аминда була дигән нәтиҗәгә туры китереп, без N3825A һәм N3825S алышынуы белән мөһим NMPylation калдыкларын күзәттек.Кызык, икенче Asn Ала яки Сер белән алыштырылса, nsp9 UMPylation тагын да көчлерәк кими (10 тапкыр артык), ә Аланы 3, 4, һәм 6 позицияләрдә алыштыру nsp9 UMPylationга уртача йогынты ясый (2 нче рәсем) ).5С).Охшаш нәтиҗәләр ATP, CTP яки GTP ярдәмендә алынган (SI кушымтасы, С8 рәсем).Коллектив рәвештә, бу мәгълүматлар N2826 (nsp9дагы 2 позиция) nsp9 NMPylationдагы төп ролен күрсәтәләр.
Nsp9 N-терминалы белән NMPylation арасында функциональ корреляциянең өстәмә дәлилләрен алу өчен, без Коронавирус гаиләсенең nsp9 эзлеклелегенең берничә эзлеклелеген тигезләдек (104 һәм 113 калдык арасында үзгәрә) (SI Кушымта, Рәсем) S6).Гомумән алганда, төрле имезүчеләргә, кошларга һәм сөйрәлүчеләр хуҗаларына зарар китерүче Ортокоронавирина субфамилиясенең 5 төрендәге 47 (билгеле һәм путатив) төрдә барлыгы 8 калдык кына инвариант дип табылды.Иң киң үзгәрешләр, шул исәптән бетерү һәм кертү, nsp9ның икенчел структур элементлары арасындагы циклда күзәтелде, алдагы структур тикшеренүләр (26 ?? 28).Nsp9ның C-терминал өлешенең β полосасында һәм α геликсында биш инвариант калдык табылды.Өч инвариант калдык Nsp9 N терминусының NNE мотивын тәшкил итә.Ачыкланганча, бу мотивның икенче Асн бердәнбер инвариант калдык, ул шулай ук ерак бака коронавирусының гипотетик nsp9 белән уртаклашыла, һәм Альфалетовирус Летовирина субфамилиясендә Микрохила летовирус 1 төрен күрсәтә.Nsp9 икенчел структура элементларында калдыкларны саклау, катлаулы яки билгеле РНК бәйләү үзлекләрен саклау өчен структур уйланулар белән рационализацияләнергә мөмкин.Ләкин, бу фикерләү NNE-ны саклауга кагылмый кебек, һәм бу өйрәнү алдыннан трипептид эзлеклелегенең үзгәрүен чикләүче чикләүләр табигате тулысынча яшерелгән иде.
Коронавирус репликасында nsp9-NMPylation һәм NNE саклауның мөһимлеген ачыклау өчен, без HCoV-229E мутацияләрен җитештердек, алар nsp9 N-терминал калдыкларының бер яки икеләтә алмашынуларын йөртә, бу nsp9 NMPylation витрода зарарлы булуын күрсәтә.Эшләгәнче, без бу алмашлыклар (nsp8 | 9 ярылу урыны янында) C-терминал pp1a өлкәсенең протеолитик эшкәртүенә йогынты ясыймы дигән сорауга җавап бирергә тырышабыз.Nsp9-ның N-терминусында тиешле алмашлыкларны үз эченә алган nsp7-11 полипротеин конструкцияләре җыелмасы Э.Колида җитештерелгән һәм Mpro рекомбинанты белән киселгән.Дүрт мәйданның протеолитик ярылуы (nsp9 карандаш сайтын да кертеп), кертелгән алмаштыруларга (SI кушымтасы, S9 рәсем) зур йогынты ясамый, Mpro-mediated nsp8 | 9 ярылуга комачаулаган бу протеиннардагы структур үзгәрешләрне исәпкә алмаганда. сайты.
Huh-7 күзәнәкләре геном озынлыгы HCoV-229E RNA белән күчерелде, сакланган NNE трипептидларында (N3825, N3826, һәм E3827) Nsp9 N терминалында Ала яки Сер алмаштыруларын кодладылар, бу мутацияләрнең күбесенең үлемгә китергәнен күрсәттеләр.Без вирусны N-терминалның Сер яки Ала (N2835A яки N2835S) алыштырып коткара алдык, ләкин NNE эзлеклелегендә (N3826A, N3826S, NN3825 / 6AA, вирусны башка һәм икеләтә мутацияләр белән торгыза алмадык). NN3825 / 6SS), E3827A) (рәсем 5D).
Бу нәтиҗәләр шуны күрсәтә: тукымалар культурасында коронавирусларның репликасы чикләнгән (шул ук яки охшаш), организмдагы nsp9 NMPylation сайтларының табигый мутациясен чикли, һәм коронавирусларның тормыш циклында бу җавапның төп ролен хуплый.
Соңгы экспериментлар җыелмасында без C-терминалын SARS-CoV-2 nsp12 һәм nsp9 дип язган His6 терминалын, һәм Э.Колида nsp12 ике мутант формасын чыгардык.NiRAN һәм RdRp доменнарындагы актив сайт калдыклары тиешенчә Ала кулланыгыз (6A һәм SI кушымтасы, S2 таблицасы).K4465 SARS-CoV-2 nsp12 HCoV-229E (SI Кушымта, С2 рәсем) K4135 белән туры килә, бу NiRAN эшчәнлеге һәм HCoV-229E репликасы өчен кирәклеген раслады (3D һәм E рәсеме).Бу калдык шулай ук EAV nsp9 K94 артериаль вирусына туры килә, моңа кадәр NiRAN үз-үзен UMPylation / self-GMPylation (16) өчен кирәк булганы күрсәтелгән.6Б рәсемдә күрсәтелгәнчә, SARS-CoV-2 nsp12 UMP күчерү эшчәнлегенә ия, nsp9ны субстрат итеп куллана, ә nsp12_K4465A актив сайт мутанты актив түгел.RdRp мотивының SDD характеристик эзлеклелегендә икеләтә алыштыру UMP күчерү эшчәнлегенә тәэсир итми (6Б рәсем), бу RdRp эшчәнлегенең nsp9 UMPylation'да туры эффект юклыгын күрсәтә.Охшаш мәгълүматлар CTP, GTP һәм ATP ярдәмендә алынган (SI кушымтасы, S10 рәсем).Йомгаклап әйткәндә, бу мәгълүматлар NiRAN-арадашлы nsp9 NMPylation коронавирусларда консерватив активлыкка ия булуын күрсәтәләр, ортокоронавирус субфамилиясенең төрле төрләрен күрсәтәләр.
SARS-CoV-2 nsp12-арадаш NMPylation nspylation.(А) Coomassie NMPylation тестында кулланылган рекомбинант белокны күрсәтүче SDS-полиакриламид гели тапланган.Контроль буларак, NiRAN доменында (K4465A) һәм RdRp доменында (DD5152 / 3AA) актив сайтны алыштырган мутант протеин кулланылды, SARS-CoV-2 nsp12.Калдык номерлау pp1ab позициясенә нигезләнгән.(B) nsp9-His6 һәм [α-32P] UTP кулланып UMPylation ачыклауның авторадиографы nsp12-His6 (кыргый тип [wt] һәм мутант).Сулда маркалы протеинның молекуляр массасы (килодальтоннарда) күрсәтелә.
NiRAN доменнары, гадәттә, Нидовиралеста саклана (16), бу аларның Nidovirus репликасы өчен кирәк булган энзиматик реакцияләрне катализацияләвен күрсәтә.Бу тикшеренүдә без коронавирусның NiRAN доменының NMP (NTP-дан ясалган) nsp9-ка күчерелүен исбатлый алдык, вирусны күчерүдә катнашкан серле РНК бәйләүче протеин (26 ?? 29), аны табигый максат итеп билгеләргә һәм коронавирус RTC партнеры.
NiRAN домены өч эзлеклелек мотивын бүлешә (AN, BN, CN), аларда бик аз санлы калдыклар бар, монофилетик, ләкин бик дифференциаль Nidovirales тәртибендә (8, 16).Соңгы тикшеренүләр күрсәткәнчә, алар структур яктан күпчелек характеризацияләнмәгән протеин киназга охшаган протеиннар гаиләсе белән бәйле, алар башта SelO гаиләсе дип аталган (17, 19, 22, 30, 31).SelO белән бәйле протеиннарның киназ катламнары бар, ләкин классик киназларда берничә сакланган актив сайт калдыклары юк (22, 32).Актив сайтка бәйләнгән һәм конкрет үзара бәйләнешләр белән тотрыклыланган ATP молекулаларының кире юнәлешенә нигезләнеп, SelO гипотезага салынган һәм соңыннан AMP (фосфат урынына) протеин субстратына (22) күчерелүе расланган, SelO шикелле тагын бер бактерия YdiU бар. күптән түгел UMP-ның Тирга һәм аның төрле протеин субстратлары калдыкларына ковалент бәйләнешен катализацияләү өчен күрсәтелде (33).
NiRAN коронавирусы доменының актив актив калдыкларын фаразлауны раслау һәм киңәйтү өчен, без коронавирус nsp12 буенча мутация анализы ясау өчен биохимик һәм кире генетика ысулларын кулландык (3D рәсем һәм E һәм SI кушымтасы, S3 рәсем һәм таблица) S1â S4).Мәгълүматлар шуны күрсәтә: HCoV-229E K4135, R4178 һәм D4280ны Ала белән алыштыру витро NMP күчерү эшчәнлеген һәм күзәнәк культурасында вирус репликасын юкка чыгара (3D һәм E һәм SI кушымталары, S3 рәсем), аларның NTP γ-фосфатта булуын хуплый. (K4135, R4178) һәм актив сайт металл ионнарын координацияләү (D4280).E4145A консервланган Глу кош оясы вирусы диапазонында K4135 (17) позициясен тотрыклыландырырга фаразланган, вируслы репликацияне бетерү өчен күрсәтелгән, ләкин гаҗәп, активлык NMPylation витрода сакланган (3D һәм E һәм SI кушымтасы, рәсем S3 һәм таблицалар S1 - S4).Салмонелла тифимурийының (E130A) YdiU гомологында тиешле алмаштыру кертелгәч, шундый ук күзәтү ясалды.Бергә тупланган бу мәгълүматлар катализатор функциясен түгел, ә сакланган калдыкның көйләү функциясен хуплый.
Сакланган Phe калдыкларын (F4281A) HCoV-229E NiRAN доменындагы нестовирус диапазонына алыштыру (8) витрода NMPylation активлыгының кимүенә һәм күзәнәк культурасында вирусның репликасының сизелерлек кимүенә китерде (3D, E һәм SI) кушымта, рәсем S3).Мәгълүматлар бу калдыкның мөһим көйләү функциясенә туры килә, мәсәлән, алда күрсәтелгән гомологик DFG мотивы Phe калдыклары.Классик белок киназаларында ул Mg2 + бәйләү әйләнәсенең бер өлеше булып, умыртка сөяген җыярга һәм көйләргә булыша???Эффектив катализатор эшчәнлеге өчен кирәк (32, 34).Ала һәм Аргны K4116 калдыкларына алыштыру (преан мотивында), вируслы репликацияне бетерде һәм, көтелгәнчә, аминокислота ягы чылбырына карап, витродагы NMP күчерү эшчәнлегенә төрле йогынты ясады (3D һәм E һәм SI кушымталары) , Рәсем S3).Функциональ мәгълүматлар структур мәгълүмат белән туры килә, бу калдыкның ATP фосфат белән үзара бәйләнешен урнаштырганын күрсәтә (17).Башка ояланган вирус гаиләләренең NiRAN доменында HCoV-229E pp1a / pp1ab K4116 позициясе Lys, Arg яки His (8) били, бу бу калдыкның функциональ чикләнүен күрсәтә.D4188A һәм D4283A-ны алыштыру ферментларның активлыгын юкка чыгара яки киметә һәм вирус репликасын бетерә (3 нче рәсем).Бу ике калдык күпчелек (ләкин барысы да түгел) ояланган вирусларда саклана (8), бу мөһим гаиләгә хас, ләкин катализатор булмаган функцияне күрсәтә.Контроль буларак Coronaviridae яки башка Nestioviridae гаиләләрендә (8) сакланмаган тагын берничә Lys һәм Asp калдыкларын (K4113A, D4180A, D4197A һәм D4273A) алыштырдылар.Көтелгәнчә, бу алмашлыклар күпчелек очракта чыдамлы, ферментларның активлыгы бераз кимегәндә һәм кайбер очракларда вируслы репликациядә (3 нче рәсем һәм SI кушымтасы, С3 рәсем).Гомумән алганда, коронавирус мутагенез мәгълүматлары EAV NiRAN-RdRp (16) үз-үзен GMP һәм кире генетика мәгълүматларына бик туры килә, анда EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ортолог) калдык K94 (HCoV-229E K4135) мөһим функцияләргә туры килә), R124 (R4178 туры килә), D132 (D4188 туры килә), D165 (D4280 туры килә), F166 (F4281 туры килә).Моннан тыш, HCoV-229E мутагенез мәгълүматлары алдан хәбәр ителгән SARS-CoV кире генетика мәгълүматларына туры килә һәм киңәйтелә, тиешле CN мотивы Phe-to-Ala мутанты SARS-CoV_nsp12 The белән охшаш. фенотип -F219A һәм HCoV-229E_F4281A тасвирланган (3 нче рәсем D һәм E һәм SI кушымтасы, S3 рәсем һәм S1-S4 таблицасы).
UTP һәм GTP (үз-үзен NMPylation реакциясендә) өчен өстенлекле булган EAV ортологлары (16) белән чагыштырганда, безнең тикшерү шуны күрсәтә: NiRAN коронавирусы (HCoV-229E һәм SARS-CoV-2 белән күрсәтелгән) эффектив булырга мөмкин. UMP өчен бераз өстенлек булса да, дүрт НМПның барысы да күчерелде (1 һәм 3 нче рәсемнәр).Конкрет NTP ко-субстратының чагыштырмача түбән спецификасы күптән түгел хәбәр ителгән SARS-CoV-2 nsp7 / 8/12/13 суперкомпозит структурасына туры килә, анда ADP-Mg2 + NiRANның актив сайтына бәйләнгән, ләкин аденин өлеше белән түгел. конкрет үзара бәйләнеш формалаштыру (17).Безнең тикшерүдә, NMPylation реакциясендә кулланылган нуклеотид төре мутант белок эшчәнлегенә дифференциаль тәэсир итми (SI Кушымта, С3 рәсем), бу калдыкларның берсенең дә билгеле бер нуклеобаза бәйләнеше белән тыгыз бәйләнештә булмавын күрсәтә.Коронавируслар һәм артериаль вирусларның NiRAN доменнарында күзәтелгән төрле NTP ко-субстрат өстенлекләренең структур нигезе һәм потенциаль биологик әһәмияте өйрәнелергә тиеш;алар дөрес булырга мөмкин, яисә тиешле уку чикләре аркасында булырга мөмкин.Хәзерге вакытта, артериаль вирус NiRAN доменының потенциаль NMPylator эшчәнлеге (элек характерланган үз-үзен NMPylation эшчәнлеге белән чагыштырганда) артерия белән коронавирусның охшашлыгын исәпкә алып, башка суб-субстрат өстенлеге бар дип искәртеп булмый. NiRAN домены аның чикләрендә.Эзләүгә нигезләнгән чагыштыру (16).Mg2 + ны кофактор итеп кулланган SelO псевдокиназасы белән чагыштырганда, коронавирус һәм NiRAN артериаль вирусы активлыгы Mn2 + (16) белән бәйле (3C рәсем һәм SI кушымтасы, S1 рәсем).Mn2 + бәйләнеше һәм UTP өчен ачык өстенлек - NMPylators белокының гадәти булмаган үзенчәлеге, һәм күптән түгел Салмонелла тифимурийының YdiU протеинында расланды, ул күзәнәкләрне стресс индукциясеннән саклау өчен каты Mn2 + -ка бәйле протеин шапероны UMPylation катализаторы. 33).
Күптән түгел тасвирланган коронавирус NiRAN домены һәм кәрәзле белок киназлары арасында структур охшашлык (17, 19) NiRANның NMP-ны ковалент рәвештә бу тикшеренүдә хәбәр иткән башка протеиннар белән бәйләү мөмкинлегенә өстәмә ярдәм күрсәтә.Без мөмкин булган NiRAN максатларын HCoV-229E ORF1a кодланган протеиннарга юнәлттек, алар турыдан-туры яки турыдан-туры RTC-ның ORF1b-кодланган репликасына булышалар (12, 35).Безнең экспериментлар nsp9 эффектив һәм конкрет NMPylation өчен төгәл дәлилләр китерә (2 нче рәсем).Әгәр дә максатлы протеин ферменттан (nsp12) 8-10 тапкыр артыграк булган моляр артык кулланылса, nsp9 тулысынча (моно) NMPized булуы раслана (4 нче рәсем).Nsp12 белән nsp9 арасындагы үзара бәйләнеш кыска вакытлы һәм nsp9 белән тотрыклы комплекс барлыкка килмәячәк дигән нәтиҗәгә килдек (бүтән RTC субунитлары булмаганда).Бу нәтиҗә SARS-CoV протеомында протеинның үзара бәйләнешен өйрәнә (35).MS анализы Nsp9 калдыкларының N-терминал калдыкларының төп аминын NMPylation сайты итеп билгеләде (SI кушымтасы, S5 рәсем).Фосфорамида бәйләнеше һәм N-терминал аминокруппасы формалашуы NiRAN-арадаш NMPylation эшчәнлеген Pseudomonas шприцы SelO-mediated AMPylation реакциясеннән аера, бу Сер, Тр яки Тир калдыкларында O-бәйләнгән AMP формалашуны катализацияли ( 22), һәм С.Тифимурий YdiU O-бәйләнгән (Тир белән) һәм N-бәйләнгән (Аның белән) пептид-UMP кушылмалары.SelO белгечләр гаиләсендә булган чикләнгән мәгълүмат шуны күрсәтә: бу зур белок гаиләсе әгъзалары пептид-НМП кушылмалары формалашуда бик нык аерылып торалар.Бу кызыклы күзәтү, алга таба өйрәнергә кирәк.
Бу тикшеренүдә алынган мәгълүматлар NMP9 NMPylation бушлай N-терминус таләп итә дип фаразларга этәрде.Вируслы репликация контекстында, бу nsp8 | nsp9 эшкәртү мәйданының протеолитик ярылуы белән тәэмин ителәчәк, Mpro һәм pp1ab арадашлашкан полипротеин pp1a репликасында.Күпчелек коронавирусларда бу конкрет сайт (VKLQ | HCoV-229E) һәм башка коронавирус Mpro ярылу урыннары арасындагы аерма Asn (Ала, Сер яки Гли кебек кечкенә калдык түгел) P1âны били???Урыны (36).Беренче тикшеренүләрдә алынган пептид ярылу мәгълүматлары nsp8 | nsp9 сайтының ярылу эффективлыгы бүтән сайтларныкыннан түбән булуын күрсәтте, бу 1) бу конкрет сайтның C-терминалны вакытында координацияләнгән эшкәртүдә көйләүче роль уйный алуын күрсәтә. pp1a өлкәсе, яки 2) a вирусны күчерүдә махсус сакланган nsp9 N-терминусның роле (37).Безнең мәгълүматлар (рәсем 5A) күрсәтте, чын N-терминал эзлеклелеген алып барган nsp9 рекомбинант формасы nsp12 белән эффектив NMPized.N-терминалның эзлеклелеге Xa факторы белән алынды (nsp9-His6; SI кушымтасы, таблица S1) яки Mpro-арадаш ярылу (nsp7-11-His6; рәсем 5A һәм SI кушымтасы, S1 таблицасы).Иң мөһиме, nsp9 булган прекурсор nsp7-11-His6 NMP12 NMPylation каршылыгын күрсәтте, бу безнең мәгълүматларга туры килә, nsp9-NMP кушылмасы N-терминал төп амин аша барлыкка килүен күрсәтә (SI кушымтасы, С5 рәсем) .NiRAN субстрат үзенчәлеген тирәнрәк аңлау өчен, без nsp9 күрше N-терминал калдыкларына игътибар иттек.Башка протеиннар булмаганда, алар структур яктан сыгылучан, nsp9 (26 28, 38) язылмаган формасында табылырга комачаулыйлар, аларның чикләнгән табигый үзгәрүен күрсәтәләр Бу мөһим эзлеклелектә (икенчел структура белән бәйле түгел). nsp9 N-терминал фрагменты.Ала бу төбәктә сакланган калдыкларны алыштыру (5C һәм D һәм SI кушымтасы, С8 рәсем) N3826 витрода nsp9 NMPylation өчен мөһим, N3825A һәм E3827A алмаштырулары NMPylation кимүенә китерә, M3829A һәм P3830A алмаштырулары юк. .Билгеле, nsp9 NMPylation тәэсир итә.N-терминалын Asn (N3825A, N3825S) алыштыру nsp9 NMPylation һәм күзәнәк культурасында вирус репликасына уртача йогынты ясаса да (5C һәм D рәсем), N-терминалдан Asn калдык эзлеклелеген бетерү 3825-NN диепептиды Вируслар өчен үлемгә китерә, N-терминусында бер Asn калдыклары, яхшырак Асн таләп ителә, шуңа охшаш калдыкларны алыштыру өлешчә түзеп була кебек (5B, C, D).Без нәтиҗә ясыйбыз, 3825-NN диепептиды, аеруча коронавирус диапазонында сакланган һәм кирәкле N3826 калдыклары (SI кушымтасы, С6 рәсем), NiRANның актив сайтында nsp9 N-терминусның дөрес бәйләнешен һәм юнәлешен тәэмин итә.
Ала (E3827A) барлык субфильмнарның сакланган Глуына алмаштыру nsp9 NMPylation витрода саклый, ләкин күзәнәк культурасында вируслар өчен үлемгә китерә (рәсем 5C һәм D), бу калдыкның өстәмә функциясен күрсәтә, мәсәлән, төп үзара бәйләнештә (NMPylated яки үзгәртелмәгән) ) nsp9 N-терминус һәм вирусны күчерүдә катнашкан башка факторлар.Nsp9 мутацияләре nsp9 протеолитик процессына яки аңа кушылган nsps (39) тәэсир итмәде (SI Кушымта, С9 рәсем), бу күзәтелгән берничә nsp9 мутациясенең үлем фенотиплары C протеолитик процесс-терминал pp1a өлкәсенең дизрегуляциясе аркасында булмаганын күрсәтә. .
Aboveгарыдагы мәгълүматлар дәлилләр китерә, pp1a / pp1ab-та nsp8 | 9 ярылу мәйданын Mpro-арадаш дәвалаганнан соң, nsp9 N-терминалы UMPylated булырга мөмкин (яки бүтән NMP белән өлешчә үзгәртелә).Моннан тыш, Nsp9 N-терминусын искиткеч саклау (коронавируслар гаиләсендә бердәнбер һәм инвариант Асн калдыкларын да кертеп) һәм бу тикшеренүдә алынган кире генетика мәгълүматлары (3E һәм 5D рәсемнәр) безне тасвирланган nsp9 NMPylation дигән нәтиҗәгә китерде. биологик бәйләнешле һәм коронавирусны кабатлау өчен кирәк.Бу модификациянең функциональ нәтиҗәләре өйрәнелергә тиеш, мәсәлән, алдан тасвирланган (специфик булмаган) nsp9 (үзгәртелмәгән форма) РНК бәйләү эшчәнлеге (2628).N-терминал NMPylation шулай ук nsp9ның протеин яки РНК субстратлары белән үзара тәэсиренә яки төрле дүрт дәрәҗә җыелышлар формалашуга тәэсир итә ала.Болар структур тикшеренүләрдә күзәтелделәр һәм коронавирус репликасы белән функциональ бәйләнештә булулары расланды, бигрәк тә бу модификация булмаган очракта (26- ââ29, 40).
Коронавирус NiRAN доменының максатчан спецификасы тагын да җентекләп характерланырга тиеш булса да, безнең мәгълүматлар шуны күрсәтә: коронавирус NiRAN доменының протеин максатчанлыгы бик тар.Барлык нидовирус гаиләләренең NiRAN доменында төп актив сайт калдыкларын саклау (8, 16) булса да, сакланган NMPylator бу протеиннарның активлыгын хуплый, бу доменның кесә калдыкларын субстрат бәйләүче характеристика булып кала. , һәм Nidovirales максатларының төрле гаиләләре арасында төрле булырга мөмкин.Шулай ук, башка ояланган вирусларның тиешле максатлары әлегә билгеле түгел.Алар nsp9 яки башка протеиннарның ерак ортологлары булырга мөмкин, чөнки оя корылган вирусларда сакланган биш реплика доменыннан тыш эзлеклелек азрак саклана (8), шул исәптән Mpro һәм NiRAN арасында геном массивы, алар арасында nsp9 урнашкан коронавирус.
Моннан тыш, без хәзерге вакытта NiRAN доменының өстәмә (кәрәзле) максатлары булу мөмкинлеген кире кага алмыйбыз.Бу очракта, NMPylators (NMPylators) (30, 31) протеинындагы бактерия гомологларының "мастер регуляторлары" бар кебек?NMP төрле кәрәзле протеиннарны аларның агымдагы эшчәнлеген көйләү яки бетерү өчен модульләштерә, шуның белән кәрәзле стресс реакциясе һәм редокс гомостаз кебек биологик процессларда роль уйный (22, 33).
Бу тикшеренүдә (2 һәм 4 нче рәсемнәр һәм SI Кушымта, S3 һәм S5 рәсемнәр), без nsp12 UMP (NMP) өлешен nsp9'да бер (консервацияләнгән) позициягә күчергәнен исбатлый алдык, калган протеиннар үзгәртелмәгән. кулланыла торган шартларда, яхшы билгеләнгән (иркен түгел) субстрат үзенчәлеге ярдәм итә.Моның белән эзлекле, N-терминал nsp9 NMPylation белән чагыштырганда, nsp12′ның үз NMPylation активлыгы бик түбән, аны ачыклау озынрак авторадиография экспозиция вакытын таләп итә, һәм nsp12 концентрациясенең 10 тапкыр артуы кулланыла.Моннан тыш, безнең MS анализы nMP12 NMPylation өчен дәлилләр китерә алмады, бу NiRAN доменының үз-үзен NMPylation (иң яхшысы) икенчел эшчәнлек булуын күрсәтә.Ләкин, әйтергә кирәк, башка тикшеренүләр NMPylator бактериясенең үз-үзен ампиляцияләү статусы аларның NMPylation эшчәнлеген башка протеин субстратларында контрольдә тота алулары турында беренчел дәлилләр китерделәр (22, 33).Шуңа күрә, EAV nsp9 (16) һәм коронавирус nsp12 (бу тикшеренү) өчен хәбәр ителгән үз-үзеңне NMPylation эшчәнлегенең мөмкин булган функциональ эффектларын тикшерү өчен күбрәк тикшеренүләр кирәк, шул исәптән C-терминал RdRp домены катлауга шаперонга охшаган эффект (шул исәптән). 16)).
Элегерәк, нидовираль NiRAN доменының түбән агым функцияләре турында берничә гипотеза каралган, шул исәптән РНК лигасы, РНК белән капланган гуанилат күчерү һәм протеинны эшкәртү эшчәнлеге (16), ләкин аларның берсе дә агымдагы функцияләргә туры килми.Түбәндәге позицияләрдә алынган мәгълүмат өстәмә фаразлар ясамыйча бер үк вакытта.Бу тикшеренүдә алынган мәгълүматлар NiRAN доменының протеин-РНК синтезы инициативасында катнашуын раслый (ләкин исбатлый алмый).Элегерәк 5-тә NiRAN домены функциясе дип ышанганнар ??²-РНК каплау яки РНК лигация реакцияләре бу һәм башка мәгълүматларга булышмый.Шуңа күрә, мәсәлән, NiRANның актив сайты консервланган Asp-ны гомуми база итеп җәлеп итү дип санала (Peludomonas syringae SelO; D4271 HCoV-229E pp1ab; D208 SARS-CoV-2 nsp12) (SI Кушымта, 2 нче рәсем) ).S2) (17. 41).Моннан тыш, консерваланган протеин максатлары өчен коронавирус NiRAN-ның искиткеч эзлеклелеге һәм NTP ко-субстратлары өчен җиңел спецификация (UTP-ны өстен күрә) NiRAN-арадашлы каплау ферментына яки RNA лигазасына охшаган функцияләргә каршы.
Билгеле, тикшерү өчен бик күп өстәмә эш кирәк, һәм исбатланса, nsp9-UMP (nsp9-NMP) протеин белән эшләнгән РНК синтезында мөмкин булган рольне эшкәртү, бу алдан хәбәр ителгән берничә кызыклы, ләкин (әлегә кадәр) отчетларны тоташтырачак. .Аерым күзәтүләр.Мәсәлән, коронавирусның тискәре полосалы РНК ахыры олиго (U) чыбык белән башлана (42, 43).Бу күзәтү тискәре полосалы РНК синтезы UMPylated формасын nsp9 поли (A) койрыгына (триггерларга) бәйләү белән башланган дигән фикер белән туры килә, бу аның РНК бәйләнеше ярдәмендә активлашырга һәм / яки үзара бәйләнештә булырга мөмкин. бүтән RTC протеины.Nsp9 белән тәэмин ителгән UMP өлеше аннары nsp7 / 8 / nsp12-арадашлы олигуридиляция өчен "праймер" буларак кулланылырга мөмкин, геномик РНКдагы 3 ?? poly-поли (A) койрыгын яки бүтән олиго (A) булган эзлеклелектә. picornavirus VPg протеины өчен төзелгән механизмга охшаган шаблон булып хезмәт итә (44).Әгәр дә тәкъдим "норматив булмаган" булса????(Протеин-индуктив) тискәре полосалы РНК синтезы инициативасы күзәтүләргә сылтама бирә, коронавирус тискәре полосалы РНКның ахырында UMP (UTP урынына) булуын күрсәтә (42), бу күрсәтү өчен санала нуклеин кислотасы Дисер билгесез уридинга хас булган эндонуклаз белән фосфориатланган ахырны ярып җибәрә.Әгәр дә расланса, бу нуклеин кислотасы гидролитик активлыгы олигомерик UMPylated формасын nsp9 барлыкка килүче тискәре юлның 5 ² очыннан чыгарырга булыша ала.Протеинны эшкәртүдә nsp9-ның мөмкин булган роле шулай ук элеккеге кире генетика тикшеренүләренә туры килә, алар күрсәткәнчә, nsp9 (һәм nsp8) коронавирус геномының 3 очында консервацияләнгән РНК элементы белән критик һәм махсус үзара бәйләнештә торалар.45).Бу доклад буенча, бу алдагы күзәтүләр хәзер яңадан тикшерелергә һәм алга таба тикшеренүләр аша киңәйтелергә мөмкин.
Йомгаклап әйткәндә, безнең мәгълүматлар N-терминалда RdRp белән бәйләнгән вирус ферментының билгеле активлыгын билгеләделәр.Коронавируста, яңа ачылган NiRAN-арадаш UMPylator / NMPylator эшчәнлеге Mn2 + һәм янәшәдәге Asn калдыкларына таяну өчен кулланыла һәм N-терминалдагы төп амин белән (аз энергияле) фосфорамида бәйләнешләре барлыкка килә.Nsp8 | 9 ярылу мәйданында Mpro-арадаш ярылу аша, nsp9 максаты NMPylation өчен кулланылырга мөмкин, бу протеаз һәм NiRAN домены арасында RdRp кадәр сузылган функциональ бәйләнешне күрсәтә.Nsp12 NiRAN актив сайтында һәм nsp9 максатында төп калдыкларны саклау, SARS-CoV-2, шул исәптән ике коронавирустан алынган мәгълүматлар белән берлектә, nsp9 NMPylation коронавирус консерватив үзенчәлекләре вирусны күчерүдә төп адым булып тора.Мөмкин булган мәгълүматлар нәтиҗә ясарга этәрә: NMPylated nsp9 формасының протеин белән эшләнгән РНК синтезында коронавирус һәм башка ояланган вируслар өчен акыллы сценарий, һәм NiRAN башка билгесез протеиннарны да максат итеп куя ала.Вирусны көйләгез.Хостның үзара бәйләнеше.Әгәр дә расланса, вируслы РНК синтезында протеин примерларының катнашуы Mpro / 3CLpro һәм RdRp доменнарының эзлеклелеген арттырачак, элек ачыкланган коронавирус һәм пикорнавирус сыман супер группа (9), алар күптән түгел оешкан Писонивиритларда берләштеләр (9). 46) категориядә.
Безнең мәгълүматлар шулай ук күрсәтә, бу тикшеренүдә ачыкланган төп, сайлап алынган һәм консерватив фермент эшчәнлеге вируска каршы препаратлар өчен кулланыла ала.NiRANның актив сайтында сакланган nsp9 N-терминусны бәйләүгә (һәм аннан соң үзгәртүгә) комачаулаган кушылмалар эффектив һәм күпкырлы антивирус препаратларына эшләнергә мөмкин, алар төрле (суб) нәселдән булган хайваннар һәм кеше коронавирусларын дәвалау өчен яраклы. , шул исәптән SARS-CoV-2 һәм Якын Көнчыгыш сулыш синдромы Coronavirus.
Бу тикшеренүдә җитештерелгән коронавирус протеинының кодлаштыру эзлеклелеге RT-PCR белән HCoV-229E яки SARS-CoV-2 белән зарарланган Vero E6 белән изоляцияләнгән РНК ярдәмендә көчәйтелде һәм стандарт клонлау процедуралары ярдәмендә кертелде.pMAL-c2 (Яңа Англия биология лабораториясе) яки pASK3-Ub-CHis6 (47) экспрессор векторы (SI Кушымта, S1 һәм S2 таблицалары).Бер кодны алыштыру PCR нигезендә сайтка юнәлтелгән мутагенез белән кертелде (48).MBP кушылу протеинын чыгару өчен, E. coli TB1 күзәнәкләре тиешле pMAL-c2 плазмид конструкциясе белән үзгәртелде (SI кушымтасы, S1 таблицасы).Берләштерелгән протеин амилоза якынлыгы хроматографиясе белән чистартылган һәм Xa факторы белән ярылган.Соңыннан, C-терминалы His6 тамгаланган протеин Ни-имобилизацияләнгән металл якынлык хроматографиясе (Ni-IMAC) белән чистартылган (49).Убукуитин кушылу протеинын чыгару өчен, Э. coli TB1 күзәнәкләре тиешле pASK3-Ub-CHis6 плазмид конструкциясен кулландылар (SI Кушымта, S1 һәм S2 таблицалары) һәм pCGI плазмид ДНК кодлау убукуитинга хас C-терминал гидролаз 1 (Ubp1).Трансформация (47).C-терминалы His6 тамгалы коронавирус протеины алдан әйтелгәнчә чистартылган (50).
HCoV-229E nsp12-His6ның үз-үзен NMPylation тесты EAV nsp9 (16) тасвирланганча башкарылды.Кыскасы, nsp12-His6 (0,5 µМ) 50 мм 4- (2-гидроксиетил) -1-пиперазинетанезульфон кислотасы (HEPES) -KOH, pH 8.0, 5 мм дитиотрейтол (DTT), 6 мм MnCl2, 25 µM буфер, инкубат. күрсәтелгән NTP һәм 0.17 µM туры килде [α32-P] NTP (3000 Ci / ммол; Хартман Аналитик) 30 ° C 30 минутта.Nsp12-mediated nsp9 NMPylation бүтән (стандарт) NMPylation анализларында реакция шартлары түбәндәгечә көйләнә: nsp12-His6 (0.05 µM) һәм nsp9-His6 (4 µM) 50 мм HEPES-KOH (pH 8.0) булганда. ), 5 мм DTT, 1 мм MnCl2, 25 µM NTP күрсәтте, һәм 0,17 µM туры килде [α32-P] NTP.30 минутта 10 минут инкубацияләгәннән соң, реакция үрнәге SDS-PAGE үрнәк буферы белән кушылды: 62,5 мм трис (гидроксиметил) аминометан HCl (pH 6.8), 100 мм DTT, 2,5% SDS, 10% глицерол һәм 0,005% бромофенол зәңгәр.Белгеч 90 минутта 5 минут җылытып, 12% SDS-PAGE белән аерылды.Гель Coomassie Brilliant Blue эремәсе белән тоташтырылган һәм буялган (40% метанол, 10% сират кислотасы, 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250), деколизацияләнгән һәм 20 сәгать дәвамында фосфорсентлы күзәтү экранына эләгә (NMPylation'тан nsp12 табу өчен); яки (максимум) 2 сәгать (nsp9 NMPylation бәяләү өчен).Экранны сканерлау өчен Тайфун 9200 имагеры (GE Healthcare) һәм ImageJ сигнал интенсивлыгын анализлау өчен кулланылды.
MS анализы өчен NMPylation анализында 1 µM nsp12-His6 һәм 10 µM nsp9 (гексахистидинсыз) кулланылды һәм 500 µM UTP һәм GTP концентрациясенең артуы кулланылды.Аларның концентрациясенә һәм көтелгән аксым сыйфатына карап, MassPrep баганасы (Су) белән җиһазландырылган Waters ACQUITY H-Class HPLC системасы 1-10 µL буферланган протеин эремәләрен он-лайн эшкәртү өчен кулланылды.Сусызландырылган белок Synapt G2Si масса спектрометрының (Су) электроспрай ион чыганагына түбәндәге бу градиент А (су / 0,05% форм кислотасы) һәм В буферы (ацетонитрил / 0.045% форм кислотасы) аша чыгарыла, һәм багана температурасы. 60 ° C һәм агым тизлеге 0,1 мл / мин: 2 минут эчендә 5% A белән изократик, аннары сызыклы градиент 8 минут эчендә 95% B, һәм тагын 4 минут 95% B саклагыз.
Масса диапазоны 500 - 5000 м / з булган уңай ионнар табыла.Глю-фибринопептид В 45 секунд саен автоматик масса дрифт коррекциясе өчен үлчәнә.MassLynx инструмент программасын MaxEnt1 киңәйтү белән кулланыгыз, төп спектрны чыгарганнан соң һәм тигезләгәннән соң уртача спектрны чишү өчен.
UMPylated HCoV-229E nsp9 эзлекле дәрәҗәдәге үзгәртелгән трипсин (Серва) кушып үзләштерелде һәм төнлә 37 ° C инкубацияләнде.Хромабонд C18WP әйләнү баганасы (өлеш саны 730522; Махерей-Нагель) пептидларны сусызландыру һәм туплау өчен кулланылган.Ниһаять, пептид 25 µЛ суда эретелде, анда 5% ацетонитрил һәм 0,1% форм кислотасы бар.
MSрнәкләр MS тарафыннан Orbitrap Velos Pro масса спектрометры ярдәмендә анализланган (Термо Фәнни).Соңгы нано HPLC системасы (Dionex), махсус урнаштырылган 50 см белән җиһазландырылган ??75 μm C18 RP баганасы 2,4 мм магнит мишәрләр белән тутырылган (доктор Альбин Майш High Performance LC GmbH) Proxeon наноспрай чыганагы аша онлайн масса спектрометрына тоташыгыз;300 µм эчке диаметрга 6 µЛ трипсин ашкайнату эремәсе салыгыз × ??1 см C18 PepMap концентрациягә кадәрге багана (Термо Фәнни).Су / 0,05% форм кислотасын эретүче итеп кулланып, үрнәк автоматик рәвештә 6 µL / мин агым тизлегендә дезализацияләнде.
Түбәндәге градиентлар су / 0,05% форм кислотасы (эретүче А) һәм 80% ацетонитрил / 0,045% форм кислотасы (В эретүче) триптик пептидларның агым тизлегендә 300 nL / мин: 4% B өчен кулланылды. 5 минут, аннары 30 сызыклы градиент берничә минут эчендә 45% В, һәм сызыклы арту 5 минут эчендә B 95% эретүче В.Хроматографик багананы дат басмаган корыч нано-эмитерга (Проксон) тоташтырыгыз, һәм элуентны 2300 V потенциалын кулланып масса спектрометрының җылытылган капиллярына сибегез. Орбитрап масса анализаторында 60,000 резолюция белән тикшерү сканеры бәйләнгән ким дигәндә өч мәгълүмат MS / MS сканеры белән, 30 секунд эчендә динамик рәвештә чыгарыла, орбитрапны ачыклау белән берлектә сызыклы ион тозак бәрелеше яки югары энергия бәрелеше диссоциациясе кулланып, резолюциясе 7500.
Пост вакыты: Август-03-2021